脲酶是氮素循环过程中的一种关键的含镍寡聚酶，土壤脲酶直接参与土壤中含氮有机化合物的转化，其活性可表征土壤中的氮素状况^[1-2]。一般认为，土壤脲酶的酶活性与土壤中有机物的含量和土壤微生物的数量等正相关^[3]，多地实验表明施加有机肥比无机肥的烟田土壤脲酶酶活更高，施用有机肥使土壤脲酶活性稳定并维持较高水平^[4-6]。土壤脲酶的活性随着烟草的生育期变化，不同时期变化速率不同，烟田土壤的脲酶活性从团棵期到旺长期缓慢增强，从旺长期到现蕾期增速加快，但从现蕾期到采烤前期快速下降，之后于采烤的后期上升至旺长期水平^[7-8]。脲酶活性的变化反映了植烟土壤氮素的转化、积累、供应效应与土壤保肥性之间的协调性^[9]。烟田土壤脲酶活性与烟株发病程度也有一定的相关性，例如随着黑胫病发病程度加重，烟株根际脲酶活性降低^[10]。

土壤脲酶来自土壤微生物, 如土壤细菌、真菌等。细菌在土壤中的种类和数量较多, 并具有较强的产酶能力^[11-12]，脲酶活性细菌是与土壤脲酶的性质和数量有直接关系的一类微生物^[13-14]。近年来已经从土壤中分离出许多产脲酶菌。张知晓等^[15]分离的土壤脲酶活性细菌分属于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）2大类群，包括厚壁菌门的杆菌属（Bacillus）、芽孢八叠球菌属（Sporosarcina）和芽孢杆菌属（Lysinibacillus）以及变形菌门的产碱杆菌属（Alcaligenes）和假单胞菌属（Pseudomonas）等，认为土壤脲酶活性细菌优势类群是厚壁菌门，同时也存在变形菌门菌株。新西兰学者的研究表明枸橼酸杆菌等9种细菌以及瓜枝孢菌等24种真菌参与了牧场土壤中尿素的代谢^[16]。也有学者从苗圃根际土壤分离到芽孢杆菌（Bacillus）和芽孢八叠球菌（Sporosarcina）等产脲酶菌株^[17-18]。这些微生物编码的脲酶基因包括结构基因ureA、ureB、ureC和辅助基因ureD、ureH、ureE、ureF和ureG等，其中结构基因ureA、ureB、ureC分别编码γ、β、α亚基，组成尿素酶原，而辅助基因编码蛋白协助将Ni²⁺传递至脲酶活性中心，激活酶原^[19]。

褐土在河南省境内主要分布于沙河与伏牛山一线之北，京广线以西的偏西北区域^[20]，自然状态下褐土的有机质含量多为4%~8%，耕种土壤在2%以下。之前的宏基因组测序结果显示河南地区褐土中产脲酶微生物主要为链霉菌、节杆菌和不动杆菌等细菌，足马杜拉分枝菌等真菌以及亚硝化球菌等古细菌^[21]。这些微生物编码的脲酶基因种类繁多，但是其中哪些脲酶基因表达能最终发挥作用尚不清楚。宏转录组测序技术（Metatranscriptomic sequencing）通过对特定时期、特定环境样品中所有微生物群落的转录本进行大规模高通量测序，可以直接获得环境中可培养和不可培养的微生物基因表达信息，目前已经越来越多地在环境微生物学，医学微生物等领域应用^[22-24]。为此，对来自河南省平顶山、洛阳、许昌、郑州和安阳等市的5个高脲酶活性土壤样本富集培养，进行土壤微生物RNA提取、建库及转录组测序，分析脲酶基因在转录水平的表达丰度，并对微生物来源进行解析，旨在明确褐土尿素代谢中微生物的作用。

1 材料与方法 1.1 土壤样品的采集

采样时间为2018年6~10月，采样地点为郑州市上街区和荥阳市、洛阳市洛宁县、平顶山市郏县、许昌市襄城县及安阳市林州市的农田。取样深度为0~10 cm土壤，采用5点混合法进行土壤取样，剔除杂物后装入塑料自封袋，置于10~15 ℃通风条件良好处保存。每个地级市取样10份，共取土样50份，对其脲酶活性进行检测^[21]，选取各市脲酶活性最高的土壤样品进行下一步实验。

1.2 产脲酶菌的富集培养

洛阳、许昌、郑州、安阳和平顶山脲酶活性最高的土壤样品分别为XC-10、ZZ-07、AY-06、LY-07和PDS-01，每个样品取样3次（10 g/份），共15份，分别加入含有50 mL液体培养基（蛋白胨1.0 g/L、氯化钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.8 g/L、葡萄糖1.5 g/L、硫酸镍0.1 g/L、酚红0.016 g/L、尿素20 g/L，pH 7.0）^[25]的250 mL三角瓶中，在30 ℃摇床中180 r/min振荡培养24 h，接着将15瓶富集培养产物进行混合，用液氮冰冻后放入-70 ℃冰箱保存。

1.3 土壤RNA的提取

使用Powersoil土壤总RNA提取试剂盒（美国Mobio公司）进行土壤RNA的提取，操作按照试剂盒说明书进行。采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度并使用紫外分光光度计（美国Nanodrop公司）检测RNA的纯度和浓度，将提取的RNA置于-70 ℃冰箱中保存。

1.4 RNA的逆转录与建库

利用DNA探针与RNaseH酶促反应特点，采用Ribo-off rRNA去除试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）对土壤微生物总RNA进行处理，以获得能够满足后续文库构建的mRNA及其他非编码RNA产物，接着采用VAHTS^TM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina^®试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）对产物进行逆转录、双链cDNA合成、cDNA片段化修饰、磁珠纯化及片段化分选、文库扩增等处理。文库用8%的PAGE胶电泳检测，利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA进行精准定量。

1.5 测序及生物信息学分析

使用Hiseq测序仪（美国Illumina公司）进行双端测序，双向各测150 bp。对原始数据质量值等信息进行统计，并使用FastQC软件对样本的测序数据质量进行可视化评估。使用Trimmomatic软件^[26]去除带N碱基的序列、reads中的接头序列和低质碱基，随机从Clean数据中抽取10 000条序列与NCBI NT数据库进行BLASTN比对，取e-value ≤1e -10并且相似度>90%、覆盖度>80%的比对结果，计算其物种分布，进行污染检测。使用Trinity软件^[27]将clean数据de novo组装成转录本，参数min_kmer_cov 2，其余默认。使用TransDecoder软件预测Unigene的CDS并翻译成蛋白序列。将获得的基因和蛋白序列与包括NR、COG、eggNOG等在内的相关数据库进行比对，获得基因的功能及物种注释信息^[28-30]。将拼接得到的转录本作为参考序列，使用Bowtie2将质控后的测序序列与参考序列进行比对，并通过RSeQC软件统计比对结果^[31]。计算每个特异基因的TPM（每百万序列转录本数，Transcripts per million）值以分析其表达丰度。

2 实验结果 2.1 褐土产脲酶微生物的宏转录组测序

对各地区脲酶活性最高的土壤样品XC10、ZZ07、AY06、LY07和PDS01进行富集培养，提取土壤RNA后进行宏转录组测序和分析，初步获得总数据量14 187 012 298 bp，拼接后获得数据量271 Mb及1 106 689个转录本，预测特异基因940 402个，N50为262 bp，最大基因长度18 629 bp，平均长度288.18 bp（表 1）。

2.2 转录本的微生物来源

富集后转录本与NCBI数据库进行比对，结果表明序列匹配数超过10条的有4 567种菌株，序列匹配数在10~99条之间的菌株种数最多，为3~408条序列（图 1），其中丰度最高的10个菌株为Acidobacteria bacterium DSM 100886、Brevibacillus choshinensis、Agromyces sp. NDB4Y10、Candidatus Rokubacteria bacterium CSP1-6、Bacillus fordii、Gemmatirosa kalamazoonesis、Comamonas testosteroni、Arthrobacter sp. Soil736、Cupriavidus necator和Sporosarcina koreensis等（图 2）。

2.3 脲酶基因的筛选与注释

通过注释筛选3个及以上拷贝的转录本，共获得122个脲酶结构基因与115个脲酶辅助基因。其中脲酶结构基因包含93个ureC（α亚基）、16个ureB（β亚基）及13个ureA（γ亚基）；脲酶辅助基因中有29个ureD、12个ureE、36个ureF、29个ureG、5个ureH和4个ureJ。利用脲酶结构基因与辅助基因编码的蛋白序列对NCBI的非冗余蛋白库（Non-redundant database，NR）进行BLASTP分析，结果（图 3）表明，122个脲酶结构蛋白和NCBI的NR库收录序列的同源性为78%~100%，其中脲酶结构蛋白α、β和γ亚基与NR库收录序列的同源性在90%~100%之间的分别有75、5和12个。115个脲酶辅助蛋白和NR库收录序列的同源性为64.25%~99.95%，UreD、UreE、UreF、UreG、UreH及UreJ和NR库收录序列的同源性在90%~100%之间的分别有7、5、9、20、1和3个。而UreD、UreF和NR库收录序列相似度低于80%的蛋白较多，分别有11个和13个。

2.4 脲酶基因的表达情况

如图 4所示，ureC、ureB、ureA、ureD、ureE、ureF、ureG、ureH和ureJ等脲酶基因中，编码α亚基的ureC基因数量最多，表达值TPM在0~1之间的有66个，1~2之间的有21个，大于2的有6个，最高的DN897996_c0_g1为3.16。编码β亚基的ureB基因有16个，表达值TPM在0~1之间的有12个，1~2之间的有4个。编码γ亚基的ureA基因有13个，表达值TPM在0~1之间的有9个，1~2之间的有4个。另外ureD、ureE和ureF的表达值最高的分别为5.31、2.00和2.71，其中ureD表达值TPM超过2的有3个转录本，分别为DN911511_c0_g1（2.03）、DN893873_c0_g1（3.31）和DN907166_c3_g2（5.31）。ureH和ureJ数量较少，表达值也较低。

2.5 脲酶基因的微生物来源

脲酶基因的属来源如表 2所示。芽孢杆菌属Bacillus、芽孢八叠球菌属Sporosarcina、节杆菌属Arthrobacter、链霉属Streptomyces和类芽孢杆菌属Paenibacillus等属细菌具有较多的脲酶结构基因和辅助基因在转录水平表达，芽孢杆菌属Bacillus中有39个脲酶基因在转录水平表达，其中结构基因ureC、ureB和ureA各有8、3和1个表达，ureD、ureE、ureF、ureG和ureH等脲酶辅助基因分别有10、3、6、6和2个表达在mRNA水平被检测到。芽孢八叠球菌属Sporosarcina中有24个脲酶结构基因和辅助基因在RNA水平表达，包括ureC、ureB、ureD、ureE、ureF和ureG等，其中脲酶辅助基因ureC和ureF数量最多，分别为9个和7个。节杆菌属Arthrobacter中ureC、ureB、ureD、ureF和ureG等脲酶基因，分别有5、2、4、6和3个基因在转录水平表达。链霉属Streptomyces细菌在RNA水平表达的有ureC、ureB、ureA、ureD、ureF和ureG等基因，其中ureC较多，有10个基因。此外，还发现了Paenibacillus、Candidatus、Bradyrhizobium、Pseudarthrobacter、Ralstonia及Cupriavidus等属细菌的脲酶结构基因和辅助基因转录的mRNA。

3 讨论

张知晓等^[15]研究发现从云南昆明市农田土壤分离出的9种产脲酶菌分别来自厚壁菌门的杆菌属、芽孢八叠菌属、芽孢杆菌属以及变形菌门的产碱杆菌属、假单胞菌属等。沈琼雯^[32]从贵州喀斯特地区的160份土壤中成功鉴定了343株产脲酶细菌，有25属79种，大部分为革兰氏阳性菌，其中优势菌属是芽孢杆菌属、肠产气杆菌属、假单孢菌属和类芽孢杆菌属，分别占比15.19%、12.66%、12.66%和5.06%。之前的研究采用宏基因组测序方法对河南省代表性褐土中的脲酶微生物来源进行了分析，发现褐土脲酶中主要细菌来源有芽孢杆菌属、节杆菌属、链霉菌属、芽孢八叠球菌属、不动杆菌属、类芽孢杆菌属和假单胞菌属等，产脲酶真菌与足马杜拉分枝菌、蓝莓枝枯病菌和嗜热毛壳菌等亲缘关系较近，古细菌中亚硝化球菌、氨氧化古菌和奇古菌等可能也参与了褐土中尿素的降解^[21]。本研究通过BLAST比对分析，在mRNA水平表达的脲酶结构基因和辅助基因与芽孢杆菌属Bacillus、芽孢八叠球菌属Sporosarcina、节杆菌属Arthrobacter、链霉属Streptomyces、类芽孢杆菌属Paenibacillus、念珠菌属Candidatus、类芽孢杆菌属Bacillales、慢生根瘤菌Bradyrhizobium、假节杆菌属Pseudarthrobacter、劳尔氏菌Ralstonia、贪铜菌属Cupriavidus、丛毛单胞菌属Comamonas、赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus、细杆菌属Microbacterium和中华根瘤菌属Sinorhizobium等细菌的亲缘关系最近。未检测到编码脲酶的真菌和古细菌的存在，可能是因为细菌在褐土氮素供应状态转化中作用更为关键。Bacillus、Sporosarcina、Arthrobacter、Streptomyces和Paenibacillus等5个属mRNA水平表达的脲酶结构基因和辅助基因总共108个，占所有表达脲酶基因的45.6%，这些属的细菌在褐土脲酶活性的发挥中起着重要的作用，下一步将对它们的特异抑制剂进行重点研究。

细菌脲酶是由2~3个不同亚基组成的杂聚肽，其中α亚基在其中起到至关重要的作用。褐土的宏转录组测序分析显示编码脲酶结构蛋白α亚基的ureC基因数量最多，为93个，这些基因在RNA水平也维持较高的表达丰度，说明ureC在褐土中尿素的代谢中有着较为重要的作用，其高表达也与褐土的高脲酶活性一致。UreF和UreG形成一个复合物，使酶原对镍离子处于感受态，促进镍离子有效地结合到活性位点。有研究表明ureF基因的敲除能够降低脲酶活性^[33]，这里褐土中ureF基因表达丰度较高，其丰度最高的转录本TPM值达到了5.37，ureF的高表达可能是褐土脲酶活性较高的原因之一。UreD在脲酶金属中心组装过程中是镍插入位点的促进剂也是招募其他辅助蛋白的支点，有研究表明产气克雷伯氏菌的UreD是可溶的，并结合2个当量的镍离子，UreD不存在时无法激活脲酶^[2]。褐土微生物中ureD基因的数量和表达值都相对较高，可能与其在脲酶活性发挥中的重要角色有关。而其他基因ureB、ureA、ureE、ureH及ureJ数量相对较少，说明其在脲酶复合体的组成中占比可能较低，在脲酶酶活性中的作用相对较小。

4 结论

通过褐土微生物RNA的宏转录组测序，共筛选到转录水平表达的122个脲酶结构基因（93个ureC、16个ureB和13个ureA）以及115个脲酶辅助基因（29个ureD、12个ureE、36个ureF、29个ureG、5个ureH和4个ureJ）。ureB、ureA、ureG、ureH和ureJ等基因在RNA水平的表达相对较低，TPM值都在2以下，ureC、ureD、ureE和ureF等基因的TPM值绝大多数都在2以下，个别高于2。细菌来源的芽孢杆菌属Bacillus，芽孢八叠球菌属Sporosarcina、节杆菌属Arthrobacter、链霉属Streptomyces和类芽孢杆菌属Paenibacillus等5个属在褐土脲酶酶活的发挥中贡献度较大。